往期的科普我们主要关注针对DNA或者RNA分子的检测技术与应用，这次我们把视角聚焦到中心法则第三个重要组成部分—蛋白质。蛋白质作为生理功能的主要扮演者，在基础科研与临床医学中也发挥着重要的作用，目前对于蛋白的检测技术也比较成熟，但面临微量的蛋白检测时仍存在一定的挑战，今天小编就给大家介绍一种针对微量蛋白检测的技术，有望推动蛋白检测进入“超敏时代”

一、免疫滚环扩增技术（Immuno-RCA）的概述

图 1 Immuno-RCA检测原理示意图

免疫滚环扩增（Immuno Rolling Circle Amplification，Immuno-RCA），是免疫识别与滚环扩增（RCA）相结合的高灵敏生物检测技术，兼顾抗体-抗原识别的高特异性，以及核酸滚环扩增极强的信号放大效应，可将单次抗原-抗体结合反应放大生成数千份核酸拷贝，适配荧光、电化学等多种信号读出方式，支持单分子检测、多靶标同步分析、细胞/组织原位成像等应用场景。

二、Immuno-RCA基本流程

1. 捕获与特异性识别：利用固相载体（玻片、微球、电极）表面固定捕获抗体或核酸捕获探针，特异性抓取样本中的靶标生物标志物；再加入偶联核酸引物的检测抗体/适配体，与靶标形成夹心免疫复合物，使核酸引物锚定在靶标结合位点，构建近距离反应结构。

2. 环化与滚环扩增：引入锁式探针（可环化DNA模板），借助DNA连接酶形成闭合环状DNA，也可以直接加入环形模版。若采用邻近连接模式，则依靠配对探针的互补序列完成环化引导。随后在恒温条件下依靠phi29聚合酶启动RCA，持续合成长链单链滚环扩增产物RCPs，链上包含大量重复结合位点。

3. 信号标记与结果读出：长链RCP可与荧光标记寡核苷酸、有机荧光染料、贵金属纳米粒子等探针杂交，产生荧光、电化学、SERS光学信号；单分子级RCP斑点还可直接数字化计数，实现极低浓度靶标的精准定量检测。

三、Immuno-RCA技术优势与应用局限

（一）核心技术优势

1. 超高检测灵敏度：依托滚环扩增的强效信号放大特性，可将检测下限降至飞摩尔（fM）至阿托摩尔（aM）级别，理论上可实现单分子靶标检测；RCP 携带海量重复结合位点，支持多重标记叠加放大，灵敏度远超传统ELISA。

2. 多靶标并行检测（多重化）：为不同靶标的抗体连接序列互不相同的核酸引物，搭配专属环形模板与荧光编码标签，单次反应即可同步区分多种标志物，适配生物芯片、编码微球、二代测序等多检测平台。

3. 等温反应、平台兼容性强：全程恒温扩增，无需PCR仪的变温模块；可直接耦合固相微球、电化学电极、组织切片等载体，适用于临床即时检测（POCT）与细胞原位成像场景。

（二）应用局限与实验注意事项

1. 实验体系复杂、成本较高：相较于传统ELISA，额外增加抗体-核酸偶联、锁式探针设计、连接酶/聚合酶体系，操作步骤更多，成本更高。

2. 非特异扩增风险：核酸扩增体系极易受外源核酸污染，必须设置阴性对照，搭配严谨的封闭、洗涤步骤，降低非特异性吸附带来的背景信号干扰。

3. 定量结果依赖校准：RCA属于局域原位扩增，扩增效率、探针杂交覆盖率易受实验条件波动；精准定量需采用数字单分子计数或梯度标准品绘制校准曲线以修正误差。

四、Immuno-RCA临床应用案例

1)  悬浮微球阵列耦合免疫滚环扩增（iRCA-SBA）—— 多肿瘤标志物同步筛查

悬浮微球阵列（Suspension Bead Array，SBA）通过不同尺寸、荧光编码的微球实现多指标并行检测，即每种微球表面固定特异性捕获抗体，可独立识别对应肿瘤标志物。iRCA-SBA方案将偶联核酸引物的检测抗体与靶标抗原形成夹心复合物，经RCA生成RCP，荧光探针标记后以流式细胞仪读取微球编码与荧光强度。相较于传统单指标检测分次检测，该技术仅需要一份血清样本，便能同时筛查前列腺特异性抗原（PSA）、癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）三类高发肿瘤标志物，适配常规医院流式设备，无需配备大型专属仪器。检测下限达：PSA 3.1 pg/mL（约0.1 pM）、CEA 9.1 pg/mL（约50 fM）、AFP 0.66 pg/mL（约9fM），灵敏度较传统SBA提升100~1000倍，动态区间宽，与临床样本检测结果匹配度高。

图2  iRCA-SBA 多因子检测原理示意图

2) 电化学适配体传感——胃癌特异性外泌体精准识别

胃癌细胞释放的外泌体是胃癌早期无创筛查的理想指标，但常规检测只能判断“样本有没有外泌体”，无法区分其细胞来源。该方案构建了电化学适配体特异性锁定胃癌来源外泌体，联合Immuno-RCA的检测，以金电极表面固定CD63捕获抗体，抓取血浆内全部外泌体；再引入胃癌外泌体特异性适配体-引物复合物，仅胃癌来源外泌体可结合并启动RCA。扩增产物RCP包含大量G-四链体重复序列，与Hemin结合形成类HRP活性的DNA酶，催化H₂O₂产生电化学信号，电极捕捉电流信号实现精准定量。该方法灵敏度优异，最低可检出954个/mL胃癌外泌体，抗基质干扰能力强，有效解决了传统检测特异性不足、灵敏度低的难题，适配胃癌早期无创血浆筛查场景。。

图3 免疫RCA电化学传感检测胃癌外泌体原理示意图

3) 邻近连接介导RCA——完整低密度脂蛋白（LDL）颗粒精准定量

低密度脂蛋白（LDL，俗称 “坏胆固醇”）由载脂蛋白B（ApoB）和外层胆固醇脂层共同构成，仅完整LDL颗粒具备心血管致病风险。传统血脂检测仅单独测总胆固醇或游离ApoB，无法区分完整致病LDL与无活性脂蛋白碎片，易高估心血管患病风险，检测精准度存在短板。

该方案采用ApoB抗体与胆固醇结合蛋白探针，只有两种探针同时结合在同一完整LDL颗粒且空间距离足够近，才能介导锁式探针环化启动RCA。RCP可激活荧光-淬灭基团的发夹探针，恢复荧光信号实现定量。若仅单独存在胆固醇碎片或游离ApoB，探针无法完成邻近连接与扩增，从机制上规避假阳性信号。该方法检测下限7.3 mg/dL，针对代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）临床样本的检测结果，与传统ELISA高度吻合，可精准量化致病活性LDL颗粒，为心脑血管风险精准评估提供可靠数据。

图 4 邻近连接 RCA 检测 LDL 原理示意图

五、总结

免疫滚环扩增（Immuno-RCA）融合免疫识别的特异性与核酸等温扩增的高灵敏度，完美解决传统免疫检测对极低丰度生物标志物信号不足、灵敏度受限的痛点，让血清微量肿瘤标志物、血浆肿瘤外泌体、完整致病性脂蛋白颗粒等难检测靶标实现可视化、数字化精准定量。

现有研究已在肿瘤联合筛查、癌症无创早期诊断、心血管风险分层等临床转化场景验证了Immuno-RCA的独特优势，但面向大规模医院常规应用，仍需要进一步简化操作流程、统一校准标准、建立完善核酸污染防控体系，以降低技术应用成本与设备门槛，推动Immuno-RCA从科研实验走向临床常态化、规模化应用。

六、参考文献

Zhang L, Bai H, Zou J, et al. Immuno-Rolling Circle Amplification (Immuno-RCA): Biosensing Strategies, Practical Applications, and Future Perspectives[J]. Advanced Healthcare Materials, 2024.

Huang R, He L, Xia Y, et al. A Sensitive Aptasensor Based on a Hemin/G-Quadruplex Assisted Signal Amplification Strategy for Electrochemical Detection of Gastric Cancer Exosomes[J]. Small, 2019.

Zhang X, Li J, Yang M, et al. Accurate and sensitive low-density lipoprotein (LDL) detection based on the proximity ligation assisted rolling circle amplification (RCA)[J]. Analytical Methods, 2024.

Gao M, Lian H, Yu L, et al. Rolling Circle Amplification Integrated with Suspension Bead Array for Ultrasensitive Multiplex Immunodetection of Tumor Markers[J]. Analytica Chimica Acta, 2019.

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