在组学科研领域，空间转录组技术能完美保留组织的原始空间位置，让基因表达数据和组织形态结构一一对应，实现“看得见的基因表达”，是解锁微环境、发育与疾病机制的科研利器。但不少科研人都会遇到同一个难题：明明实验流程和分析参数都没有问题，最终数据却信噪比低、重复性差，甚至直接报废。

这就不得不提起数据质量的最大决定因素--样本本身。空间转录组对样本的要求远严于常规转录组测序——它不仅需要完好的核酸分子，更需要完整的组织空间结构。这也是很多看似“合格”的普通组学样本，无法用于空间实验的原因。许多老师满怀期待地把存了几年的珍贵样本送出去，结果拿到数据后才发现——组织碎了、RNA降解了、信号一片模糊。花了几万块，得到的却是“无效数据”。

为了避免这种遗憾，下面聊聊关于样本质量被问得最多的几个问题，结合实战经验，帮你判断：你的样本，到底能不能做空间组？以及针对空间转录组样本从取材到切片再到保存的全流程攻略。

一、判断样本质量，主要看什么？

在空间转录组实验中，判断样本质量主要看两个维度：RNA完整性、组织形态。简单来说空间转录组是对组织的“空间形态结构+基因表达”的双重检测，这就决定了所有样本筛选的两大核心底线，缺一不可。结构垮了，空间信息就没了；RNA坏了，基因数据就废了。所有样本适配标准，都是围绕这两个核心条件延伸而来。

1. RNA完整性：数据质量的关键指标

空间转录组主要分成两大类技术平台：捕获测序类和杂交成像类。选择不同的技术原理的平台，对应的评判标准也不尽相同，常用的判断方式有四个：

（1）28S:18S 核糖体RNA比值（凝胶电泳）

真核细胞中，核糖体RNA占总RNA的80%左右。提取的总RNA跑电泳时，28S和18S是两条最显眼的主带。正常情况下，28S与18S的分子数量比例约为1:1，但因为28S的长度（约5000 nt）是18S（约2000 nt）的2.5倍，所以电泳时28S条带会更亮。根据经验，高质量样本的RNA一般28S:18S亮度比值在1.8~2.0。

⚠️ 小贴士：传统观点认为28S比18S更容易降解，所以降解样本中该比值会降低。但实际情况因组织类型而异，且该指标依赖肉眼判断，主观性较强。目前在空间组样本质控环节中已经用得越来越少了。

（2）RIN值（NGS测序平台冷冻样本的金标准）

RIN全称RNA Integrity Number（RNA完整性指数），是一个从1到10的数值，10代表完全完整，1代表完全降解。它是通过毛细管电泳自动生成的峰图计算出来的，比肉眼判断28S:18S更客观。对于快速冷冻包埋的样本，RIN ≥ 7是理想状态，RIN < 4就不建议上机。

图1.在完整程度不同的样品上检验RNA 完整值（来源：Agilent Technologies）

⚠️ 小贴士：RIN值主要适用于未经甲醛固定的冷冻组织。固定过的样本（如FFPE）由于交联作用，RIN值普遍很低，但不代表样本不能用。另外，RIN值对于成像类平台参考价值有限——因为这类平台只检测RNA中的一段序列，对RNA长度要求较低，更能容忍降解。

（3）DV200（FFPE样本的质控救星）

DV200是指长度大于200个核苷酸的RNA片段占比。对于FFPE样本，RIN值往往只有2-3，但DV200 ≥ 50%一般就可上机，<30%风险较高。另外，对于某些对RNA片段长度要求不高的捕获测序平台，DV200比RIN值更有参考意义。

⚠️ 小贴士：不过也有文章证实：DV200与基因检出数之间几乎没有相关性（西班牙学者Daniela Grases实验室的文章发表<<A Practical Guide to Spatial Transcriptomics: Lessons from over 1000 Samples>>）。

图2.测量组织中RNA的DV200（来源：Agilent Technologies）

（4）内参基因预实验质控（最准最全面的质控方案）

以上方法都是“测RNA总量或片段分布”，而还存在一种更直接的办法：跳过评估，直接取同批样本根据实际流程做内参基因的预实验。

该方案虽然成本更高，但它能综合反映RNA的可利用性、样本处理条件、自发荧光背景情况以及与实验方案的兼容性，是最让人安心的判断方式。

图3.使用ACTB、GAPDH作为质控基因评估样本降解程度（来源：鲲羽生物）

2. 组织形态：最容易被忽略的指标

空间转录组的另一关键是保留细胞在组织中的原始位置信息。大家往往只盯着RNA降解程度，但组织形态的影响力同等重要。即使RNA保存得再好，下面这几个问题没解决好，照样影响最终的数据质量。

（1）切片平整吗？

褶皱、破损、卷曲、厚度不均、气泡——这些看着是小毛病，对结果影响却很严重：

· 褶皱/卷曲 → 同一位置堆叠两三层组织 → 空间分布错乱

· 组织破损 → RNA“满天飞” →背景噪音暴增

· 气泡 → 组织形成空洞 → 影响成像与捕获

所以说，做空间组，切片技术得过硬。

图4.组织形态的问题汇总（来源：鲲羽生物）

（2）组织贴附紧密吗？

脱片是空间组实验最常见的失败原因之一。除了玻片本身粘附性差，有些组织天生难贴，比如细胞密集极高或脂肪含量高的组织。一旦脱片，前功尽弃。

尤其是需要做多轮检测与成像的样品，组织贴附的紧密程度与牢固性尤为关键。

（3）细胞完整吗？有没有自溶？

自溶的组织没有清晰的细胞形态，信号分配会严重失真。

· 如果只做基因表达定位，影响还算可控；

· 但要做共表达分析，信号分配不准会直接拉高错误率。

自溶的根源往往也很直接：组织缺血后处理不及时，组织等不了，自己先“溶”为敬。

综上来说，RNA好是必要条件，形态好才是充分条件。切片平整、贴附牢靠、细胞完整——三者缺一不可。

了解完样本质量标准，下一个引发思考的问题接踵而至：样本怎么保存？ 毕竟，大多数科研人的样本不是现做现用的——可能是三年前手术室取出来的石蜡块，也可能是-80℃冻了五年的“老古董”。面对这些“压箱底”的珍贵样本，大家最想问的就是：它们还有救吗？下面我们就分情况说清楚。

二、样本怎么保存？

1. “上古样本”（存了好多年的）还能做空间组吗？

这是被问得最多、也最让人揪心的问题。一般可分两种情况：

情况一：石蜡包埋（FFPE）样本

FFPE样本是病理科的“家常便饭”，也是上古样本的主力军。过去大家普遍认为FFPE样本RNA降解严重、没法做转录组，但空间转录组技术的进步正在改写这一认知。有研究在保存了9年的乳腺癌FFPE样本中，照样清晰画出了肿瘤基因表达空间图谱——癌区、免疫区、坏死区，甚至不同的肿瘤细胞亚型都能区分出来^[1]，其他也有不少长时间保存的FFPE样本做空间组的成功案例^[2,3]。

图5.室温保存的“上古”FFPE样本也可以有良好的检测结果（来源：鲲羽生物）

那么，存了5年、10年甚至20年的FFPE蜡块，怎么判断能不能用？

（1）主要看取材时的操作规不规范——这比保存时间更重要

实际上，FFPE样本就是为长期保存设计的。石蜡中没有RNA酶的反应条件，还能隔绝外源降解因素，所以保存时间不是影响成败的关键，当年取材时的操作质量才是决定性因素^[4]。比如离体后是否及时固定（缺血时间越短越好）、固定液是否足量（组织与福尔马林体积比1:10以上）、固定时间是否适中等。

（2）也取决于你用什么技术平台——不同平台对石蜡样本的友好程度差别很大

基于poly(A)捕获的测序平台对FFPE比较敏感，因为甲醛交联会降低RNA的捕获效率，导致信号偏弱；而基于成像的平台兼容性更高，因为FFPE样本里甲醛交联会降低测序平台对RNA的捕获效率——杂交是原位反应，不需要把RNA解离出来，所以受影响远小于测序平台。

情况二：冷冻（OCT包埋）样本

（1）主要看是否固定

在取材规范的前提下，是否使用固定液（10%中性甲醛/4%多聚甲醛）对冷冻样本的保质影响巨大：

· 固定后包埋的冰冻样本：固定能有效抑制内源性RNA酶的活性，虽然其不如FFPE稳定，但完整包埋块-80℃放半年到一年都可尝试。

· 不固定直接包埋：这种样本非常“娇贵”——只能放在-80℃且不可反复冻融；必须尽快做实验，多等一天RNA就多降解一分。建议2个月内使用，拖得越久风险越高。

如果不确定自己的样本属于哪种情况，花几百块做个RNA质检，可能帮你省下几万块的无效实验成本。

2. 既然FFPE更稳定，那全都用FFPE行不行？

各有各的好，没有绝对的“最优”，只有“最适合”^[5]。

FFPE的优势：保存时间长、细胞形态完整（冰冻样本可能被冰晶破坏结构）、背景低（脱水步骤有一定的组织透明功能）。

未固定冰冻样本的优势：对于基于捕获测序的空间组平台，未固定样本是首选。没有交联处理，平台能捕获到最高质量的RNA，数据更可靠。虽然有解交联后再捕获的方案，但其效果仍不及未固定样本。

固定后冰冻包埋--折中方案：经过固定后冰冻包埋，既降低了RNA酶的降解风险，又可进行脱水步骤保存细胞形态。此外其处理条件相对温和（不像石蜡包埋需要高温浸蜡），RNA完整性明显优于同等保存时间的FFPE样本。那么不同组织类型采用哪种包埋方式更佳，可参考之前发布的《鲲羽科普|RNA-FISH组织特异性包埋方式选择》。

样本不同包埋方式的优缺点（参考鲲羽生物送样指南）

三、怎么取材——减少降解的关键步骤

毫不夸张地说，大多数样本质量在取材处理的那一刻就已经决定了。以下是从高分文献和实战经验里总结的关键操作，每一步都是经验教训换来的：

1. 取样速度越快越好
组织离体后，内源的RNA酶（RNase）立刻开始“干活”。无论哪种包埋方式，从缺血到固定/冷冻之间的时间，必须分秒必争。时间越短，RNA完整性保留越好。

2. 减少外源RNase污染
全程手套+口罩，使用无RNase的器材和耗材。有条件的话用RNase去除剂喷洒和专用操作台。

3. 吸干表面液体，防止冰晶形成
对于冷冻包埋样本，能脱水的先脱水再包埋。不能脱水的，冷冻前用无菌纱布吸干表面的血液或液体，能有效减少冰晶形成，保护组织形态。

4. 有效固定，有助于防止降解和长期保存
不管是中性福尔马林还是多聚甲醛，固定时间不能太长也不能过短。过度固定会加剧RNA交联，时间太短又固定不彻底。一般24小时左右，不超过48小时。小体积的组织固定更均匀充分，如果组织体积太大，建议切开后再固定，确保固定液充分均匀渗透。

四、怎么切片——样本形态的重要保障

取材做好了，RNA的保存就有了保证；但想要组织形态好，切片功夫不能少。想要切片平整、美观、不脱片？无他，唯手熟尔。但如果你希望快速上手、少走弯路，这里有一条捷径：《鲲羽科普 | RNA原位杂交之切片》

如果你的样本确实降解得比较严重，也别完全放弃。技术迭代很快，说不定有新方法能让很多“被判死刑”的样本起死回生。做决定之前，不妨先问问不同技术平台的支持情况——成像类平台对降解的容忍度远高于测序平台，有些平台甚至专门为低质量FFPE样本设计了探针方案。

给样本一个机会，也给自己一个惊喜。

参考文献：

1. Zhao Y, et al. Stereo-seq V2: Spatial mapping of total RNA on FFPE sections with high resolution. Cell, 2025.

2. Bai Z, Fan R, et al. Spatially exploring RNA biology in archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Cell, 2024.

3. Cao J, et al. Decoder-FFPE-seq enables sensitive, genome-wide spatial transcriptomics of archival tissues at single-cell resolution. bioRxiv, 2025. 

4. Coudry RA, et al. Successful application of microarray technology to microdissected formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Mol Diagn. 2007.

5. Esteva-Socias M, et al. Impact of different stabilization methods on RT-qPCR results using human lung tissue samples. Sci Rep. 2020.