产前诊断

（一）产品介绍

1.产品名称

通用名称：产前染色体数目检测试剂盒

英语名称：FISH kit for the detection of chromosome numbers in prenatal diagnosis

2、包装规格

3、产前检测对象

孕妇有以下情况者，可考虑采用本试剂盒用于产前检测：

（1）高龄产妇及在早孕期反复自然流产

（2）存在即往出生缺陷病史、家族分子遗传病史及神经管缺陷家族史

（3）妊娠合并1型糖尿病、高血压、癫痫、哮喘

（4）曾暴露于药物、病毒、环境危害等不良环境中的妊娠产妇

（5）父母存在近亲的情况

（6）怀孕3个月后超声波检查发现胎儿严重异常

（7）孕妇年龄、血清学筛查或超声波检查发现其属于常染色体三体高危人群

4、适检孕期

可以在妊娠16周左右进行羊膜穿刺术，也可以在妊娠9-11周时进行绒毛膜绒毛取样检测。通过检测羊水细胞中 13 号、18 号、21 号、X 及 Y 染色体数目的异常，为产前染色体遗传性疾病的诊断提供依据。

5、检测疾病简介

21 号染色体三体（Down 综合症）、18 号染色体三体（Edward 综合症）、13 号染色体三体（Patau 综合症）、XO（Turner 综合症）、XXY（Klinefelter 综合症）、XXX 及 XYY 等 7 种遗传性疾病，主要是由于人类 21号、18 号、13号、X 及 Y 染色体数目异常而导致。而本产品主要用于检测羊水细胞中21号、18号、13号、X 及 Y 染色体的数目的异常变化所引起的疾病，主要如下：

（1）21号染色体三体（Down综合症）

21三体或唐氏综合症（Down syndrome (DS)），是由一条额外的染色体产生的，这条额外的染色体随后被标记为 21 号，因此在临床发生这种情况被称为 21三体。这是一种常见的染色体缺陷病，是常见、容易辨认的一种智力缺陷，大约每700名新生儿中就有一人患有这种缺陷，俗称先天愚型。唐氏综合症发生率与母亲怀孕年龄有相关，母龄高，卵子老化是发生不分离的重要原因；21号染色体的异常主要有三体、易位及嵌合3种类型。从 21q21 -21q22.3的这个区域被称为唐氏综合症关键区域 (DCR)。

（2）18 号染色体三体（Edward 综合症）

18三体综合症，爱德华氏综合征(Edward syndrome)，是由于个体多一条18号染色体引起。主要发生于新生婴儿，其发生率为 1/6000 至 1/8000。患者临床表现出重度智力低下，发育迟缓，新生儿期肌张力增强，以及多器官畸形，90％有心脏畸形，以室间隔缺损常见，其他有房间隔缺损、动脉导管未闭等。18三体综合症发生的主要机理是生殖细胞减数分裂过程中18号染色体不分离，超过90％起源于母方，且不分离大多发生在卵子减数分裂II期，与孕妇年龄有关。发生这种疾病的婴儿寿命一般很短，只有5-10%的婴儿活过了一岁。

（3）13 号染色体三体（Patau综合症）

13三体综合症，又叫帕托综合症(Patau syndrome)，是一种较为常见的染色体畸变疾病。在新生儿中的发病率占1/25000，并与一种特殊的畸形和严重的神经发育障碍的分布有关。大多数在分娩后即可死亡，只有6-12%患Patau综合症的婴儿能活过一岁，其中枢性呼吸暂停是造成寿命短的主要原因。大多数患儿以小颅、头皮缺损、小眼球、腭裂等多发畸形为特征；并有严重的脑发育异常、先天性心脏病、唇腭裂、腹壁发育有畸形等，其残疾程度超过Down综合症。大约90%的13三体是由于母体减数分裂Ⅰ期的不分离造成的，其次就是母亲年龄偏大，卵子老化等原因引起。

（4）XO（Turner 综合症）

Turner综合症（Turner syndrome）也称为先天性卵巢发育不全综合症，是为常见的人类染色体异常疾病之一。由于全部或者部分体细胞中缺乏一条x染色体所致，此病主要见于女孩。Turner综合症患者核型复杂多样，根据染色体核型分析可分为4类：45,X单体，嵌合体，X染色体结构异常，含有Y染色体或来源于Y染色体的片段；80%患者的染色体核型分析显示为45,X单体。该病是唯.一出生后能存活的完全单体病人，其发病率为1/2000-1/2500活产女婴。该病的临床特征主要表现为身材矮小、生长落后，性发育不良、原发性闭经，特殊的躯体特征如颈蹼、肘外翻等。

（5）XXY（Klinefelter 综合症）

Klinefelter综合症( Klinefelter Syndrome)又称先天性睾丸发育不全，是较常见的一种性染色体畸变的遗传病，是男性不育症常见的遗传学病因之一。该病主要是由于卵子或者精子在减数分裂时不分离或受精卵在有丝分裂时不分离，从而导致胎儿多出一条X染色体。在男性新生儿中发病率约为1/1000，常见的染色体核型为：47,XXY，嵌合型为：46,XY/47,XXY。本病特点表现为睾丸小而坚实、男性乳房发育、第二性特征发育不全、无精子及尿中血促性腺激素增高等。

（6）XXX

XXX综合症也称为"X3综合症"或"超雌综合症"，为女性常见的X染色体异常疾病。该病的发生率为1/1000-1/2000，主要因为母亲的生殖细胞在第二次分裂减数后期，性染色体着丝点未分开，导致产生基因型为XX的卵细胞，与父亲产生的正常基因型为X的精子结合，产生基因型为XXX的合子；或父亲的生殖细胞在第二次分裂减数后期，性染色体着丝点未分开，导致产生基因型为XX的精子，与母亲产生的正常基因型为X的卵细胞结合，产生基因型为XXX的合子。其临床特征表现为轻度到中度的智力障碍、眼距宽、面部发育不全、语言发育迟滞等，且多数患者表现为生育能力低下或无生育能力。

（7）XYY

XYY综合症(XYY syndrome)又名YY综合征或超雄综合症，它是一种性染色体异常综合症，该病在新生男婴中的发病率为1/750-1/15000。主要是因为父亲的生殖细胞减数分裂时，染色体不分裂使精子有两条Y染色体；同时该精子和卵子结合，使受精卵存在两条Y染色体所致。其临床特征表现为身材高大、肌张力低、动作不协调、面部不对称；个性残暴、易激惹、经受不住挫折，当处境不利时易于发生社会适应不良或伴发精神障碍

6、检验原理

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)是近年来在分子细胞遗传学领域发展起来的一种方法，它可以快速检测胎儿染色体异常增加或者缺失。FISH技术是利用荧光标记的特异性寡核苷酸片段作为探针，与染色体、细胞或组织中的核酸按照碱基互补配对原则进行杂交，通过荧光系统检测，对待测DNA进行定性或相对定位分析。根据目前临床医学的研究，染色体异常的活婴95%是由于21号、18号、13号、X、Y染色体非整倍体数目异常造成。本实验主要利用着丝粒特异性探针的FISH快速检测羊膜穿刺术后的非整倍体。通过穿刺搜集的羊水细胞，经过一系列预处理实验后，即进行荧光原位杂交试验，再利用荧光显微镜观察检测结果并分析即可。研究结果表明，FISH 检测这些染色体疾病的灵敏度及特异性均在 99% 以上。

7、临床意义

通过产前诊断可以从孕妇中发现怀有某些先天缺陷儿的高危孕妇，以便进一步明确诊断，对可治性疾病，选择适当时机进行宫内治疗；对于不可治疗性疾病，能够做到知情选择。而FISH在羊膜穿刺术后24-48小时内，甚至几小时即可观察检测结果，这缩短了采样和诊断之间的时间间隔；因此对紧急高危妊娠的产前诊断具有重要价值。这项技术的检测速度和可靠性大大缩短了临床医生和产妇的等待时间。

8、主要组成成分

探针光谱数据

9、储存条件及有效期

（1）储存条件：-20℃ ±3℃避光、密封储存，产品有效期为自生产之日起一年；避免反复冻融；开封后，24 小时内可在 2-8℃避光、密封储存；使用后的剩余试剂应自开封 24 小时内继续在 -20℃ ±3℃避光、密封储存；不应与有毒、有污染和有不良气味的物品混存。

（2）生产日期：见产品标签。

（3）产品有效期：见产品标签。

10、适用仪器

（1）试验仪器：荧光显微镜，所需荧光显微镜的配置包括：10×目镜，10×、40×物镜和100×油镜。

（2）试验染料：本试剂盒选用Cy3-DUTP橙红色荧光、Fluorescein-DUTP绿色荧光、DAPI蓝色荧光进行标记，建议顾客使用探针前向滤片组供应商了解所使用的滤片组的详细情况，以便选择与标记荧光染料相适应的滤片组。

11、样本要求

（1）需要新鲜采集的样本5-10ml且未经培养的羊水用于 FISH 实验玻片制作。

（2）避免样本污染：用于检测的羊水样本应避免母体血细胞污染，以防止由此可能产生的假阳性或假阴性检测结果 ；具体措施为 ：将收集的羊水样本离心沉淀后，血细胞层不能超过整个细胞沉淀层的一半，否则该样本应丢弃。

（3）收集的羊水样本应迅速、及时地处理，不要过夜。

（4）样本要避免温度过高和过低，可短时间存放于 4℃冰箱，不能冻存。

（二）检验方法

所需试剂及配制

1、20×SSC，pH5.3

可向公司购买使用，也可自行配置，配方如下

1）20×SSC：氯化钠88g、柠檬酸钠44g、去离子水400ml，三者混匀充分溶解，室温下12M HCl 调节pH值至5.3，用去离子水定容至500ml，高压灭菌。

2）2×SSC：体系50ml，20×SSC（pH5.3）10ml,、去离子水40ml，混匀后调节PH至7.0±0.2

注意：使用期间 2-8℃储存。保存期不要超过 6 个月，若试剂出现混浊或污染应丢弃。

2、甲醇/冰乙酸固定液（3:1）：现配现用

体系4ml：甲醇原液3ml、冰乙酸原液1ml，混匀，静置备用。注意：甲醇易燃，其蒸气与空气可形成爆炸性混合物；冰乙酸属低毒类，有刺激性气味，因此在配制固定液时需在通风橱中进行。

3、乙醇溶液配置（70％乙醇、85％乙醇、100％乙醇）

将700ml、850ml 无水乙醇用去离子水分别稀释至1L，使用期间2-8℃储存。

注意：试剂配制1个月后或试剂出现混浊或污染应丢弃。

4、胶原酶 B（0.005g / 5ml Hank's BSS）

称取胶原酶 B（SIGMA C6885）5mg，用 5ml Hank's BSS液溶解，37ºC 搅拌溶解 1 小时，4℃过夜，滤过消毒，-20℃分装储存

5、洗涤液配方：体系为500ml

1）0.3%NP40/0.4xSSC：10ml 20XSSC 、490ml ddH2O、1.5 ml NP40，混匀后调节PH至7.5，4℃保持。该试剂用于杂交后第一次洗脱，需72℃预热。

2）0.1%NP40/2xSSC：50ml 20XSSC 、 450ml ddH2O、0.5 ml NP40，混匀后调节PH至7.5，4℃保存。该试剂用于第二次洗脱，室温即可。

6、KCl低渗溶液（0.075 M KCl）

KCl 2.795g，去离子水 300ml

7、100µg/ml 的RNase A

1）配制RNase A储存溶液（1 mg/ml）：溶解0.001gRNase A于1ml 2×SSC（pH 7.0）中，煮沸10min，冷却至室温，-20℃分装储存。

2）配制 RNase A 工作溶液（100µg/ml）：取 100µl RNase A 储存溶液（1mg/ml）

于 900µl 2×SSC（pH 7.0）中，混匀，-20℃分装储存

8、HCl的配制

1）1MHCL：浓 HCl 8.2ml，去离子水 80ml，用去离子水定容至 100ml，室温储存。

2）0.1M HCl：取5ml 1M HCl，加去离子水定容至50ml

3）0.01M HCl：取0.4ml 1M HCl，加去离子水定容至40ml。

注意：试剂配制 1 个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染应丢弃。

9、20mg/ml 的胃蛋白酶储存溶液

溶解 20mg 胃蛋白酶（Sigma, P7000）于 1ml 无菌水中，煮沸 15 min，冷却至室温，-20℃分装储存

10、杂交液制备

1ul探针DNA，0.5ul cot1DNA，0.5ul 鱼精DNA，1ul 20xSSC，5ul甲酰胺，2ul 葡聚糖（40%），混匀备用。

样本预处理程序

1、5-10ml羊水在 1200rpm 下离心 10 min后，去上清。用 1.5-5ml 胶原酶 B

（0.005g/5ml Hank's BSS）重新吹打悬浮细胞。

2、置 37℃水浴箱中 20 min。

3、1000rpm离心 10 min，去上清，加 2-5ml KCl 低渗溶液（KCl 低渗溶液使用前在 37ºC 水浴中预热 30 min）重新吹打悬浮细胞，置 37℃水浴箱中孵育 20min。

4、缓慢加 2 ml 固定液（甲醇 : 冰乙酸 3:1）于试管中，混匀。

5、1000rpm离心10 min，去上清，轻轻吹打悬浮细胞，室温下缓慢加入5ml固定液（甲醇 : 冰乙酸 3:1）固定 10 min。

6、1000rpm离心10 min，去上清，轻轻吹打悬浮细胞，室温下缓慢加入5ml固定液（甲醇 : 冰乙酸 3:1）固定10min。

滴片及预处理程序

1、将收集到的细胞，1000rpm离心10 min，弃上清至原体积的1/50或1/100体积（例如：原羊水体积为2ml, 管内剩余固定液体积为40-50µl）。

2、滴片时重新吹打悬浮细胞，滴片应紧靠玻片滴加。（根据自己实验选择滴片的数量）

3、放置于56℃烘箱中老化玻片20min或室温下过夜老化玻片。（注：该玻片可在常温下保存2周，或在-20℃密封保存一个月）。

4、将玻片置于2×SSC（pH 7.0）溶液中，65℃煮片30min。（注：2×SSC使用前需预热至60℃）

5、将玻片依次置于-20℃预冷的70%乙醇、85％乙醇中，100％乙醇各2 min脱水。自然干燥玻片，也可以用dd水稍稍冲洗一次。

6、按照 FISH 操作步骤进行 FISH 实验。

FISH操作步骤

FISH程序可分为主要几个步骤:变性、杂交、氧化后洗涤和结果分析及评价。

1、玻片晾干后，加入提前配好的杂交液（取3µl预混的杂交液中添加Cy3-DUTP红色染料和Fluorescein-DUTP绿色染料各0.5µl混匀及相对的引物各0.5µl）；杂交液可加在盖玻片（5nm×5nm）上每个玻片加4-5µl即可，随后将盖玻片覆盖在滴片处。

注：杂交液里面的Cy3-DUTP和Fluorescein-DUTP染料需要在暗室或者避光操作，

2、利用封片胶进行封片（尽量全封），置于82℃变性10min。

3、将玻片置于湿盒中，37℃杂交杂交2-3h或者杂交过夜。

4、杂交结束后，去掉封片胶和玻片，使用预热的0.3%NP40/0.4xSSC，72℃浸泡4min。

5、接着利用0.1%NP40/2xSSC，室温浸泡4min；用dd水冲洗玻片。

6、DAPI染色1min，用100％乙醇洗涤玻片，晾干后用50%甘油封片观察.

7、FISH检测结果分析

FISH结果观察

1、判断标准 ：

1）随机计数细胞（至少计数50个细胞）：

2）若90%以上的细胞显示正常信号类型则提示为正常样本；

3）若60%以上细胞出现异常信号类型则提示为异常样本；

4）若无法判断则扩大计数至100个细胞，以判断zui后结果。

2、常见异常类型：染色体三体。

1）正常细胞：单个间期细胞核中红色及绿色信号各2个。

2）异常细胞：

单个间期细胞核中红色信号为3，绿色信号为2，表示21号染色体三体；

绿色信号为3，红色信号为2，表示13号染色体三体；

红色信号为3，绿色信号为3，表示21 号及13 号染色体同时三体。

探针组合2：CSP 18 / CSP X / CSP Y 标记颜色：天蓝/绿/红

3、常见异常类型：18号染色体三体，X或Y染色体非整倍体。

1）正常细胞：

男性单个间期细胞核中天蓝色信号2个，红色信号与绿信号各1个；

女性单个间期细胞核中天蓝色信号2个，绿信号2个。

2）异常细胞：

4、阳性判断值

1）探针组合1：GLP 13 / GLP 21 ，正常单个间期细胞核中红色及绿色信号各2 个。

2）探针组合 2：CSP 18 / CSP X / CSP Y，男性正常单个间期细胞核中天蓝色信号2个，红色信号与绿色信号各1个；女性正常单个间期细胞核中天蓝色信号 2个，绿信号2个。

（三）检验标准及注意事项

产品性能指标

1、外观

GLP 13 / GLP 21 探针溶液应为澄清、透明的粉色液体，CSP18 / CSPX / CSPY

探针溶液应为澄清、透明的浅粉色液体；杂交缓冲液应为澄清、透明的粘稠状液体。

2、荧光原位杂交探针荧光信号强度

荧光原位杂交探针在外周血淋巴细胞或羊水细胞中均应发出在镜下可被肉眼识别的信号。

3、荧光原位杂交探针质量判断（在外周血淋巴细胞中期分裂相染色体上进行）荧光原位杂交探针敏感性

1）GLP 13 / GLP 21 荧光原位杂交探针敏感性

分析50个中期分裂相中100条13号染色体，应至少有98条（98%）显示一个绿色荧光信号（DLEU 2 位点）；分析50个中期分裂相中100条21号染色体，应至少有98条（98%）显示一个红色荧光信号（DSCR2 位点）。

2）CSP18 / CSPX / CSPY 荧光原位杂交探针敏感性

分析50个中期分裂相中100条18号染色体，应至少有98条（98%）显示一个蓝色荧光信号（着丝粒位点）；分析正常男性50个中期分裂相中100条性染色体，应至少有49条（98%）显示一个绿色荧光信号（X 染色体着丝粒位点），且应至少有49 条（98%）显示一个红色荧光信号（Y 染色体着丝粒位点）。

4、荧光原位杂交探针特异性

1）GLP 13 / GLP 21 荧光原位杂交探针特异性

分析50个中期分裂相中100条13号染色体，应至少有98条（98%）杂交到13号染色体的 DLEU 2 位点；分析50个中期分裂相中100条 21 号染色体，应至少有98条（98%）杂交到21号染色体的DSCR 2 位点。

2）CSP18 / CSPX / CSPY 荧光原位杂交探针特异性

分析50个中期分裂相中100条18号染色体，应至少有98条（98%）杂交到18号染色体的着丝粒位点；分析正常男性50个中期分裂相中100条性染色体，应至少有49条（98%）杂交到X染色体的着丝粒位点，且至少有49条（98%）杂交到Y染色体的着丝粒位点。

5、荧光原位杂交探针对羊水细胞检测有效性判断

1）GLP 13 / GLP 21 荧光原位杂交探针检测正常人羊水细胞有效性判断

分析4例正常人羊水细胞，与GLP 13 / GLP 21荧光原位杂交探针杂交后，显示 2个DLEU 2 位点信号及2 个DSCR2 位点信号的细胞数应不低于90%。

2）CSP18 / CSPX / CSPY 荧光原位杂交探针检测正常人羊水细胞有效性判断分析4例正常人羊水细胞，与CSP18 / CSPX / CSPY 荧光原位杂交探针杂交后，显示2个18号染色体、2个X染色体（女性）或1个X染色体、1个Y染色体（男性）着丝粒信号的细胞数应不低于 90%。

6、荧光原位杂交探针检测患者羊水细胞有效性判断

1）GLP 13/GLP 21荧光原位杂交探针检测13号染色体三体或21号染色体三体患者羊水细胞有效性判断至少分析2例13号染色体三体患者羊水细胞，显示3 个DLEU2位点信号的细胞数应不低于60%；至少分析2例21号染色体三体患者羊水细胞，显示3个DSCR2位点信号的细胞数应不低于60%。

2）CSP18/CSPX/CSPY荧光原位杂交探针检测18号染色体三体或性染色体数目异常患者羊水细胞有效性判断至少分析2例18号染色体三体患者羊水细胞，显示3个着丝粒信号的细胞数应不低于60%；至少分析2例X染色体异常患者羊水细胞，显示异常（女性：47，XXX或45，XO，男性：47，XXY）的细胞数应不低于60%；至少分析2例Y染色体异常患者羊水细胞，显示异常（47，XYY）的细胞数应不低于 60%。

7、稳定性

试剂盒 37℃放置 7 天或在有效期末，不影响产品的性能指标。

注意事项

1、将羊水收集在不含EDTA的培养基中，因为EDTA是一种螯合剂，可以去除胶原蛋白酶活性所需的钙离子。

2、在剥离绒毛膜绒毛的过程中，使用专用的溶剂或1×PBS，以防止组织粘连导致细胞丢失。

3、预先处理过的载玻片可立即杂交或在室温下保存3周。如果需要长期存储，则需置于-20℃可放置几个月。

4、在清洗过程中，重要的是要防止样品表面干燥，否则会出现背景问题

5、杂交过程中，尽量佩戴无粉手套，以防止污染样片，出现背景杂点

6、杂交所用的试剂尽量现配现用

7、结果分析注意事项：计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞；杂交不均匀的区域和细胞核轮廓不清或有重叠及背景深导致影响信号判断的区域的不需要分析。

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